Full Text

Введение Актинобактерии рода Rhodococcus (рис. 1) являются представителями важной эколого-трофической группы микроорганизмов, окисляющих природные и антропогенные углеводороды и, следовательно, участвующих в биогеохимических циклах углерода и восстановлении загрязненных углеводородными ксенобиотиками экосистем [2]. Родококки способны к окислительной деструкции практически всех углеводородных компонентов нефти: алканов, циклических и ароматических углеводородов и их производных, сложных поли- и гетероциклических соединений. Отдельные представители рода Rhodococcus используются в составе биопрепаратов, предназначенных для биоремедиации нефтезагрязненных сред [12]. Начальным этапом процесса биодеструкции углеводородных соединений является бактериальная адгезия, интенсивность которой определяется гидрофобностью клеток и их адгезивной активностью. Бактериальная адгезия к жидким углеводородам рассматривается отдельными авторами [13, 16] как механизм образования биопленок в водно-углеводородных средах. Например, в работе [13] исследована динамика комплексного процесса пленкообразования, сопряженного с биодеструкцией полихлорированных бифенилов смешанной культурой микроорганизмов. В ряде исследований описаны математические модели бактериальной адгезии к твердым субстратам [9, 17], формирования биопленок на границе твердый субстрат - жидкость [7, 8] и жидкая среда - воздух [6], а также процессов биофильтрации газообразных выбросов и очистки сточных вод от углеводородных загрязнителей с применением биопленок [1, 3]. Однако в литературе отсутствуют модели процесса биопленкообразования в двухфазной системе несмешивающихся жидкостей. С использованием метода высокоточной межфазной тензиометрии исследована термодинамика адгезионного процесса и экспериментально подтвержден сорбционный механизм формирования биопленок родококками в водно-углеводородной системе [4, 5]. Цель настоящей работы - математическое моделирование процессов формирования и разрушения клеточных кластеров Rhodococcus ruber ИЭГМ 231 на основе экспериментальных данных по динамике межфазного натяжения на границе, разделяющей бактериальную суспензию и жидкий углеводород (н-гексадекан либо н-додекан). Экспериментальное исследование динамики межфазного натяжения в системе углеводород - бактериальная суспензия Определение поверхностного (межфазного) натяжения в системе углеводород-вода проводили методом отрыва кольца на высокоточном автоматическом тензиометре Sigma 701 (KSV Instruments, Финляндия) при температуре 25 ± 0,2 оС в течение 15-24 ч. Регистрацию результатов измерения осуществляли с использованием программного обеспечения «WinSigma» (KSV Instruments, Финляндия). В работе использовали штамм Rhodococcus ruber ИЭГМ 231 из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, WDCM # 768; www.iegm.ru/iegmcol/strains.html). Готовили водные суспензии отмытых от питательной среды клеток родококков в различных концентрациях, соответствующих показателям оптической плотности (ОП600нм) 0,25-2,0 (ОП - безразмерная величина, характеризующая степень погашения света, прошедшего через слой материала), измеряемым с помощью спектрофотометра Lambda EZ 201 (Perkin-Elmer, США) при длине волны 600 нм. В качестве контроля использовали систему вода - н-гексадекан (н-додекан) без добавления клеток. Результаты долгосрочных экспериментов по определению динамики межфазного натяжения в системе вода - н-гексадекан при различных концентрациях клеток в суспензии представлены на рис. 2. Как видно из рис. 2, равномерное снижение показателя межфазного натяжения до стабильного минимального значения наблюдалось при низкой (ОП600нм = 0,5) концентрации бактериальной суспензии. В то же время при средних (0,75-1,0) значениях ОП600нм был зарегистрирован скачкообразный характер кривой межфазного натяжения после 4,5-6 ч взаимодействия клеток с н-гексадеканом, что, по-видимому, свидетельствует о постепенной стабилизации процесса адсорбции родококков в межфазном слое. Такое же скачкообразное колебание межфазного натяжения клеточной суспензии при ОП600нм = 1,25 наблюдалось уже с первых минут в течение 8 ч эксперимента. При этом после 9 ч взаимодействия бактериальных клеток с н-гексадеканом показатели межфазного натяжения приобретали стабильный характер (28-30 мН/м), что указывает на предельное насыщение межфазного слоя клетками родококков и формирование межклеточных контактов. Стабильно низкие значения межфазного натяжения регистрировались на протяжении всего эксперимента при использовании высококонцентрированных (ОП600нм = 1,5-2,25) клеточных суспензий. Для исследования влияния природы углеводородного субстрата на динамику процесса адгезии клеток в двухфазной системе была проведена серия аналогичных экспериментов с н-додеканом (рис. 3), характеризующимся меньшей гидрофобностью, чем н-гексадекан, и, соответственно, большей растворимостью в воде. Как видно из рис. 3, в системе с н-додеканом наблюдалась сходная динамика межфазного натяжения в зависимости от концентрации клеток родококков. Скачкообразный участок кривой межфазного натяжения с последующим достижением минимального значения (27 мН/м) регистрировался при наиболее низкой (ОП600нм = 0,25) исследуемой концентрации бактериальной суспензии. При использовании суспензии клеток в концентрации, соответствующей ОП600нм = 0,5, не удалось зарегистрировать стабильных показателей межфазного натяжения на протяжении всего эксперимента. Стабилизация значений межфазного натяжения на минимальном уровне в системе с н-додеканом происходила при меньшей концентрации клеток (ОП600нм = 1,25) по сравнению с таковой в опытах с н-гексадеканом. Полученные результаты свидетельствуют о том, что родококки на границе раздела фаз вода - углеводород проявляют свойства поверхностно-активных частиц, сорбируясь на межфазной поверхности и понижая межфазное натяжение системы в концентрационно-зависимой манере до достижения минимального значения, соответствующего предельной сорбции клеток. При этом в насыщенном сорбционном слое клеток происходят образование межклеточных контактов и инициация формирования бактериальной биопленки. Инициация формирования биопленки в системе вода - н-додекан начинается при меньших концентрациях клеток в суспензии, что, по-видимому, обусловлено термодинамическими свойствами данной системы. Вероятно, площадь раздела фаз возрастает с увеличением дисперсности системы, поэтому площадь контакта клеток с н-додеканом выше по сравнению с таковой в системе с н-гексадеканом, и клетки родококков за более короткое время адсорбируются на доступной поверхности. Замечено, что стабильные показатели межфазного натяжения клеточной суспензии были примерно одинаковы (27-30 мН/м) независимо от природы углеводородного субстрата. Таким образом, снижение показателей межфазного натяжения в двухфазной системе обусловлено участием гидрофобных взаимодействий между бактериальными клетками и углеводородом. Полученные экспериментальные данные могут быть использованы для регуляции роста бактериальных биопленок в жидких гетерофазных системах. Детерминистическая биомеханическая модель зависимости поверхностного натяжения от времени Обозначим через временную зависимость концентрации клеток на межфазной границе. Будем считать, что эта зависимость имеет стандартный релаксационный вид , где - максимально достижимая концентрация, - некоторое характерное время. Зависимость поверхностного натяжения от концентрации предполагаем имеющей вид , где , , , - некоторые характерные значения , а величину можно назвать степенью образования единой пленки [13, 16, 17] на межфазной границе. Для зависимости примем следующую феноменологическую формулу: , где и - некоторые характерные значения n. Сравнивая получившуюся в итоге теоретическую зависимость (без учета случайных вариаций) с экспериментальной зависимостью при ОП600 нм = 0,75, находим методом наименьших квадратов параметры , , , , , . Теоретическая и экспериментальная зависимости сопоставлены на рис. 4, а. Вероятностная биомеханическая модель зависимости поверхностного натяжения от времени Вероятностная модель учитывает случайный характер процесса образования единой пленки бактерий. Пусть степень образования этой пленки есть случайная величина, равномерно распределенная на отрезке , где , . Получившаяся теоретическая зависимость (одна из реализаций вышеупомянутой случайной величины) и экспериментальная зависимость при ОП600 нм = 0,75 сопоставлены на рис. 4, б. Далее вероятностная модель была дополнительно усложнена. Феноменологические формулы для и получили объяснение на уровне следующей микромодели. Предполагалось, что по мере накопления клеток на межфазной границе они объединяются в кластеры [10, 11, 15]. Моделирование кластерообразования проводилось по схеме клеточных автоматов. Если одна из соседних клеток данной клетки входит в уже имеющийся кластер, то в него включается и данная клетка. Кластеров может быть много, и среди них можно выделить наибольший (рис. 5). Доля клеток, входящих в наибольший кластер, растет со временем, при этом зависимость этой доли от концентрации клеток качественно соответствует приведенной выше феноменологической зависимости . Поэтому можно считать, что доля клеток в наибольшем кластере и есть степень s образования единой пленки. Тогда отпадает необходимость в использовании искусственной феноменологической зависимости . Далее случайные вариации величины s могут быть объяснены следующим образом. Измерительное кольцо, проходя межфазную границу, разрушает встретившийся кластер с некоторой вероятностью [7, 14]. Если наибольший кластер еще не очень велик, то к следующему проходу измерительного кольца он не успевает восстановиться, и величина s остается малой, а поверхностное натяжение - большим. С течением времени наибольший кластер растет и поэтому успевает восстановиться к следующему проходу кольца; тогда величина s устанавливается близкой к единице и поверхностное натяжение становится малым. В промежуточном случае наблюдаются случайные колебания значений s. В итоге отпадает необходимость в использовании искусственной феноменологической зависимости , а зависимость имеет вид, показанный на рис. 6, т.е. совпадает с использованной при получении теоретической зависимости на рис. 4, б. Тем самым эта зависимость сохраняется, но объяснена теперь посредством микромодели формирования и разрушения кластеров бактерий. Заключение Проведено экспериментальное и теоретическое исследование динамики снижения межфазного натяжения в результате адсорбции клеток R. ruber ИЭГМ 231 на границе, разделяющей бактериальную суспензию и жидкий углеводород (н-гексадекан либо н-додекан). Выполнено математическое моделирование начального этапа образования биопленки на основе математического описания процессов формирования и разрушения клеточных кластеров. Установлено, что экспериментально наблюдаемая зависимость межфазного натяжения в системе бактерии - вода - углеводород от времени носит нерегулярный характер, поэтому детерминистическая модель может лишь качественно описать эту зависимость. Более точное соответствие между теорией и экспериментом может быть достигнуто с помощью вероятностной модели. Разработанная микроуровневая модель основана на теории насыщения адсорбционного слоя бактерий на поверхности раздела фаз и образования единой биопленки на межфазной границе углеводород - вода. В этой модели предложено теоретическое объяснение выявленной скачкообразной динамики межфазного натяжения, обусловленной прохождением измерительного кольца через формируюшуюся биопленку и случайным характером формирования - разрушения клеточных кластеров до достижения термодинамически стабильного состояния системы. Эта модель качественно и количественно описывает основные черты рассматриваемого явления. Модель допускает дальнейшее развитие, которое должно состоять в более подробном анализе механизмов поведения бактериальных клеток на границе раздела фаз.

About the authors

M. S Kuyukina

E. V Feoktistova

M. A Osipenko

I. B Ivshina

Yu. I Nyashin

References

Statistics

Views

Abstract - 27

PDF (Russian) - 11

Refbacks

• There are currently no refbacks.