Full Text

Введение Заживление ожоговой кожной раны является сложным процессом, в комплексной терапии которого особое значение придается разработке ранозаживляющих средств, обладающих широким спектром фармакологических действий и оказывающих влияние на различные звенья раневого процесса. Особенно востребованным является поиск новых препаратов для местного лечения кожных ожогов, обладающих стимулирующим эффектом на пролиферативную и синтетическую деятельность клеток. В данной работе нами было оценено влияние этилового эфира 5-(4-этоксибензоил)-5,7-дигидроспиро[циклопентан-1,6-[1,2,3]триазоло[5,1-b] [1,3,4]тиадиазин]-3-карбоновой кислоты (далее триазола) [5] на восстановление волокнистого компонента кожи в условиях заживления ожоговой раны. Ранее было показано, что производные 1,2,3-триазоло-1,3,4-тиадиазина [6] способны оказывать стимулирующее влияние на пролиферацию фибробластов [20], в том числе в условиях регенерации кожных ран [5]. Фибробласты играют ключевую роль при восстановлении целостности кожного покрова, прежде всего за счет активного синтеза компонентов межклеточного вещества, в частности различных типов коллагенов и эластинов, из которых впоследствии формируются волокна [22]. Волокнистый компонент межклеточного вещества обеспечивает механические характеристики кожи, такие как прочность и эластичность, а также участвует в определении и поддержании архитектоники дермы. Важно отметить, что среди физических характеристик биологических тканей важнейшими являются именно их механические свойства. Исследование механических характеристик тканей может дать важную информацию об их свойствах. Знание биомеханических свойств мягких тканей важно для индивидуализированного выбора рациональных приемов пластических и реконструктивно-восстановительных операций [8]. Важно понимать, что механические свойства кожи определяются не волокнами отдельного вида, а их взаимным расположением и влиянием друг на друга. Эти свойства динамичны и изменяются по мере перестройки соединительнотканных волокон под действием внешних и внутренних сил. Но так как около 60 % кожи составляет коллаген, который, в первую очередь, отвечает за его механические свойства, роль эластина обычно рассматривается только при низких напряжениях [24]. В нормальной коже коллаген присутствует обширной сетью отдельных пучков, расположенных параллельно эпидермису [3]. После повреждений кожи на месте ее глубоких дефектов, сопровождавшихся разрушением дермы, формируется новообразованная соединительная ткань - рубец [17]. Структура коллагеновых волокон в рубце отличается от нормальной кожи, что приводит к значительным функциональным нарушениям [14]. Волокна в рубце обладают меньшей дифференцированностью; наблюдается количественный дисбаланс: в келоидных рубцах обилие коллагена отмечается не только в сетчатом, но и в сосочковом слое [3; 17]. Кроме того, в рубцовой ткани коллагеновые волокна резко утолщенные, беспорядочно расположенные, эозинофильные, нередко фрагментированные, захватывают всю толщину рубца [3]. В последующем ремоделировании рубцовой ткани и восстановлении функций кожи активное участие принимают фибробласты [10; 21]. Известно, что биомеханические показатели, такие как прочность и упругая пластичность рубцовой ткани, в совокупности свидетельствуют о зрелости соединительной ткани рубца, накоплении коллагена, зрелости коллагеновых волокон и их упорядоченности. Главной причиной механических различий является архитектоника тканей, то есть способы укладки волокон и пучков, а также характер взаимодействия коллагеновых волокон с другими компонентами ткани, в том числе клеточными [7; 23; 24]. Понимание этих причин может в конечном счете детальнее объяснить роль клеток в процессах регенерации кожи, и улучшить терапевтические подходы. Характеристики кожи, такие как сопротивление деформации или разрушение под действием приложенных нагрузок, могут быть определены из механических испытаний. Самыми распространенными являются статические испытания, когда к испытываемому образцу прикладывается нагрузка с постоянной скоростью. У испытаний на растяжение есть преимущества: они показывают относительно простые зависимости напряжения от деформации, которые можно легко смоделировать и количественно оценить [15]. Испытание на одноосное растяжение является рекомендуемым механическим испытанием на основании простоты, небольшого размера образца и доступности коммерческих одноосных устройств [19]. Методами измерения прочности на разрыв можно систематическим, воспроизводимым и стандартизированным способом оценивать биомеханическое качество рубцовой ткани, образовавшейся после различных курсов лечения ран [18]. Тензиометрические испытания способны показать целостную картину изменений биомеханических свойств раневой ткани на различных этапах заживления раны, так как при таких испытаниях рубцовая ткань и неповрежденная кожа демонстрируют значительные различия в биомеханических свойствах [12; 13; 24]. Изучение биомеханики как здоровой кожи, так и шрамов дает представление о направленности здоровой ткани и о том, как она изменяется при травме. По механическим свойствам кожа является материалом, поведение которого соответствует вязкоупругому композиционному материалу, допускающему большие деформации. Ввиду наличия неоднородных слоев, характеристики которых различаются, крайне важно проводить комплексную оценку не только функциональных, но и морфологических особенностей кожи [1; 4]. Более полное понимание того, как ранение влияет на физиологические свойства кожи и ее механические характеристики, может облегчить поиск терапевтических агентов и процедур, направленных на стимуляцию восстановительных процессов в поврежденных тканях [14], а также прогнозировать их эффективность и безопасность [2]. Материалы и методы Характеристика экспериментальных групп. Моделирование ожоговой раны В качестве экспериментальных животных использовали 100 белых беспородных лабораторных крыс-самцов. Условия работы с животными соответствовали правилам Европейской конвенции ЕТ/S 129 (1986) и директивам 2010/63/EU. Для оценки общего состояния лабораторных животных, участвующих в эксперименте, производили их взвешивание, анализировали внешний вид (состояние глаз, кожных покровов, шерсти и др.) и поведение (аппетит, двигательную активность). Взвешивание животных проводили до моделирования ожоговой раны (табл. 1). В работе оценивалось влияние 1,2,3-триазоло-1,3,4-тиадиазина на восстановление волокнистого компонента кожи в условиях заживления ожоговой раны. Таблица 1 Масса тела экспериментальных животных разных групп (среднее ± ошибка среднего) Группа Масса животного, г Морфологические исследования Интакт 314 ± 16,42 Срок эксперимента, сутки 14 21 Контроль 261,85 ± 18,71 341,76 ± 20,06 Ланолин 286,62 ± 18,91 288,43 ± 7,6 Триазол 369,8 ± 13,6 391,8 ± 13,02 Пантенол 390,95 ± 14,41 389,13 ± 12,61 Тензиометрические исследования Интакт 308 ± 18,47 Срок эксперимента, сутки 14 21 Контроль 360,47 ± 15,52 336,96 ± 14,44 Ланолин 354,2 ± 23,41 361,5 ± 23,39 Триазол 387,84 ± 16,91 311 ± 20,53 Пантенол 398,66 ± 14,98 286,68 ± 9,51 Для оценки ранозаживляющего эффекта мази с добавлением триазола был выбран препарат сравнения, широко применяющийся в клинической практике для местного лечения ожогов кожи до III степени - пантенол («Пантенол-Тева», «Меркле ГмбХ», Германия). Для экспериментов было сформировано 5 групп животных по 6 (морфологические исследования) и 4 (тензиометрические исследования) особей в каждой. В пределах каждой группы (кроме интактной) животных выводили из эксперимента на 14-е и 21-е сутки: 1. «Интакт» - интактные крысы (0). 2. «Контроль» - крысы, не подвергавшиеся лечению ожоговой раны (I). 3. «Ланолин» - крысы, на раны которых наносилась мазевая основа, содержащая ланолин (II). 4. «Триазол» - крысы, подвергавшиеся лечению ожоговой раны тестируемым веществом (III). 5. «Пантенол» - крысы, на раны которых наносился препарат «Пантенол-Тевa» (IV). Для моделирования ожоговых ран шерсть на дорсальной поверхности животных выщипывалась вдоль позвоночника на ширину 300 мм и длину 400 мм. Ожог наносился в межлопаточной области путём прикладывания к депилированному участку кожи (3×3 см) раскаленных гирек из медицинской стали размером 2×2 см на 30 с, что позволило воспроизвести стандартный по размеру и глубине ожог IIIА степени. Перед нанесением ожога крысам вводился анальгин в количестве 0,2 мл в мышцу бедра. Мазь для накожного нанесения, содержащую 0,1 % (масс.) тестируемого 1,2,3-триазола, готовили растворением 400 мг вещества в 200 мкл диметилсульфоксида и добавлением этого раствора к 200 г ланолина, расплавленного при 50°С на водяной бане. К полученной мази при интенсивном перемешивании постепенно добавили 200 г стерильной воды и размешали до однородной консистенции. Чтобы избежать эффектов мазевой основы, в эксперимент была введена группа животных, на кожные раны которых наносилась мазевая основа. Основа готовилась аналогично тестируемой мази, но без добавления 1,2,3-триазола. Препараты наносили на область раны в течение 14 дней, один раз в день в количестве 0,2 г. Вывод животных из эксперимента (умерщвление) производили передозировкой диэтилового эфира. Гистологические и морфометрические исследования Биологический материал забирали таким образом, чтобы захватывалась область раны и неизмененных тканей. Для гистологического исследования кожу фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине, затем промывали в проточной воде, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и в хлороформе, затем пропитывали парафином и готовили парафиновые блоки. Толщина гистологических срезов составляла 3-5 мкм. Для оценки изменений волокнистого компонента соединительной ткани применяли окраску пикрофуксином по Ван-Гизону. Коллагеновые волокна после окраски пикрофуксином имеют ярко-красный цвет, представляют собой извитые тяжи, идущие в различных направлениях или одинаково, или соединяясь в пучки. Оценку проводили с помощью светового микроскопа Olympus при увеличении в 200 или 400 раз. Для получения цифровых фотографий гистологических препаратов использовали микроскоп Olympus. С помощью программы ToupView измеряли толщину и площадь коллагеновых волокон. Морфоколичественный анализ включал в себя оценку таких показателей, как ширина пучков коллагеновых волокон (мкм) и площадь коллагеновых волокон (%). Механические испытания Оборудование Механические испытания осуществлялись на разрывной машине Shimadzu AGX 50 kN, Япония, максимальная нагрузка машины 50 000 Н. Испытания проводились при комнатной температуре и со скоростью 10 мм/мин. Результаты обрабатывались на стандартном программном обеспечении для разрывной машины Shimadzu Trapezium X. Анализ механической прочности образцов проводили с использованием методики оценки деформационного поведения материала при одноосном сжатии. Подготовка образцов По специально заготовленному картонному трафарету (рис. 1) длиной 4 см и шириной 2 см вырезались образцы кожи так, чтобы пораженный участок соответствовал наиболее тонкому участку (середине) образца. Образцы должны иметь круглое или прямоугольное сечение, а на концах утолщаться для предотвращения их разрушения в захватах при испытании. Образцы изготавливались в соответствии с описанными в литературе методами [11; 16]. Испытания на растяжение Края образцов (самые широкие участки) фиксировались в держатели, изготовленные заранее из абразивной бумаги. При испытании на одноосное растяжение, концы образца жёстко закреплялись в захватах испытательной машины. После чего к образцу прикладывалась одноосная растягивающая нагрузка (рис. 2). Время одного испытания в среднем составило 66,573 ± 3,601 с. По достижении точки максимального механического напряжения и наступления необратимой деформации (разрывы) испытания останавливали. После проведения испытания образцы изымались из держателей. Оценивали место и характер разрыва кожного лоскута (рис. 3). Статистическая обработка результатов Статистическую обработку результатов проводили, используя компьютерные программы Microsoft Excel и Statistica 10.0. Вычислялось среднее и стандартное отклонение. Для оценки значимости различий между группами использовали критерий Манна-Уитни. При вероятности ошибки p < 0,05 различия между средними значениями считались достоверными. В программном пакете Wolfram Mathematica написаны программы для визуализации полученных данных по механическим исследованиям. Вычислялось среднее значение по группе и соответствующее стандартное отклонение. Результаты Коллагеновые волокна - это основной компонент межклеточного вещества соединительной ткани кожи, образованный фибриллярным белком коллагеном. Они обеспечивают механические характеристики кожи, такие как прочность и эластичность, а также участвуют в определении и поддержании архитектоники дермы. Синтез коллагена дермы осуществляется фибробластами. Рис. 4. Волокнистый компонент в интактной коже, окраска - Ван-Гизон; ×400 Общее содержание коллагена в дерме составляет до 70 % от сухой массы, причем содержание коллагена I типа составляет 80 % от совокупного объема коллагена. Коллаген I типа образует прочные фибриллы и обеспечивает механическую прочность дермы, причем большая его часть содержится в сетчатом слое [9]. В нормальной коже коллаген присутствует обширной сетью отдельных пучков, которые идут параллельно выраженному эпидермису (рис. 4). Пучки коллагена дискретны, но между ними существуют случайные коллагеновые или эластиновые связи [3]. На 14-е сутки эксперимента в группах «контроль» и «ланолин» в рубце преобладает клеточный элемент: новообразованные коллагеновые волокна разной степени зрелости, собраны в тонкие пучки, имеющие прямой ход и образующие мелко петлистую сеть. В группе «триазол» пучки коллагеновых волокон толстые, извитые, сложены в массивные тяжи. В группе «пантенол» пучки толще, чем в контрольной группе, однако они не образуют оформленных массивных тяжей и располагаются неравномерно (рис. 5). При анализе площади, занимаемой коллагеновыми волокнами, выявили, что на 14-е сутки эксперимента во всех группах она достоверно ниже интактного значения. В группах «контроль» и «ланолин» волокна занимают не более 55 % площади дермы. В группах «триазол» и «пантенол» волокнистый компонент приобретает тенденцию к превалированию в рубцовой ткани, в связи с чем показатели площади коллагеновых волокон достоверно повышаются (рис. 6). К 21-м суткам эксперимента во всех группах сформирован рубец с развитым волокнистым компонентом. Тем не менее имеются отличия в наблюдаемых фазах регенерации. Так, в группах «контроль» и «ланолин» активно протекает фаза пролиферации, переходящая в фазу рубцевания, что выражается в повышении зрелости рубца и появлении в нем большого количества коллагеновых волокон. Волокна разной степени зрелости собраны в пучки, имеют прямой ход, раздвинуты матриксом, содержащим функционально активные фибробласты. В группе «пантенол» волокна собраны в массивные толстые пучки, следующие параллельно друг другу. В группе «триазол» большую часть дермы занимают сильно извитые коллагеновые волокна, собранные в толстые массивные пучки. Окраска волокон намного интенсивнее, чем в группах сравнения. Основного вещества и клеток мало (рис. 7). К 21-м суткам эксперимента во всех группах наблюдается достоверное увеличение площади занимаемой волокнистым компонентом. В группе «триазол» значение приближается к интактному (рис. 8). Стоит отметить, что данный параметр достоверно изменяется во всех группах в сторону увеличения к позднему сроку. Исключение составляет группа «пантенол», где статистически данная закономерность не подтвердилась. Толщина пучков коллагеновых волокон на обоих сроках эксперимента во всех группах достоверно меньше интактного значения. Во всех группах наблюдается однонаправленная тенденция к утолщению пучков к более позднему сроку. Следует отметить, что в группе «триазол» толщина пучков волокон достоверно выше, чем в группах сравнения, что подтверждается гистологической картиной (рис. 9). Механические испытания выявили общую тенденцию зависимости толщины коллагеновых волокон от прочностных свойств кожи. Так, на 14-е сутки эксперимента все образцы имели слабые механические характеристики, достоверно отличающиеся от интактного значения (кожа до разрыва растягивается на 31,434 ± 4,921% при нагрузке в 5,082 ± 0,060 МПа). Рис. 8. Площадь коллагеновых волокон на 21-е сутки эксперимента: × - различие с контрольной группой достоверно (р < 0,05), ● - различие с группой «пантенол» достоверно (р < 0,05), *- различие с группой «ланолин» достоверно (р < 0,05), + - различие с интактной группой достоверно (р < 0,05), на доверительных интервалах отложена величина ошибки среднего Из всех опытных групп более высоким прочностным свойствам соответствовали образцы из группы «триазол»: в среднем при максимальной нагрузке в 0,804 ± 0,129 МПа образец растягивался на 28,893 ± 4,548 %. В группе «контроль» среднее значение максимальной нагрузки, при котором кожа до разрыва растягивалась на 37,751±8,437 %, составило 0,582±0,032 МПа. В группе «ланолин» кожа растягивалась на 37,680 ± 4,131 % при нагрузке в 0,756 ± 0,187 МПа. В группе «пантенол» данные показатели равны 21,875 ± 3,12 % и 0,668 ± 0,024 МПа, соответственно (рис. 10). К 21-м суткам эксперимента механические свойства образцов кожи улучшаются, что связано со значительным развитием волокнистого компонента в рубцовой ткани. Наибольшими прочностными характеристиками обладают образцы из группы «триазол»: при максимальной нагрузке в 2,077 ± 0,274 МПа, при которой в коже образовывались разрывы, образец растягивался на 27,264 ± 6,319 %. В группах «контроль» и «ланолин» определены худшие механические свойства: разрывы при нагрузке в 1,281 ± 0,125 МПа и 0,996 ± 0,317 МПа, при этом проценты растяжения равны 29,431 ± 1,353 и 39,844 ± 14,312, соответственно. В группе «пантенол» образец растягивался на 31,879 ± 3,289 %, после чего разрывался при нагрузке в 1,879 ± 0,411 МПа (рис. 11). Обсуждение Морфологические исследования свидетельствуют об интенсификации коллагеногенеза в случае использования триазолотиадиазина. Толщина пучков коллагеновых волокон, а также площадь, занимаемая ими, достоверно выше в группе «триазол». Вероятно, данный феномен связан с прямым влиянием триазолотиадиазина на пролиферативную активность фибробластов. Чем больше фибробластов оказывается в зоне рубца, тем больше компонентов межклеточного вещества они синтезируют. Однако тот факт, что на более поздних сроках эксперимента (21-е сутки), когда количество фибробластов невелико и их популяция заменяется фиброцитами, увеличение волокнистого компонента продолжается, возможно, свидетельствует о стимуляции триазолом еще и синтетической активности клеток. Результаты механических испытаний свидетельствуют, что рубцовая ткань имеет слабые механические свойства. Кожа животных всех экспериментальных групп демонстрирует слабые механические характеристики, достоверно отличающиеся от показателей здоровой кожи. Однако, к 21-м суткам эксперимента в группе с тестируемым веществом механические свойства образцов кожи улучшаются, что коррелирует с данными гистологического анализа: коллагеновые волокна образуют массивные толстые тяжи, представляют большую часть дермы. Вероятно, ввиду стимуляции триазолотиадиазином фибробластов в повреждённой коже в более быстрые сроки формируется зрелый рубец с превалированием волокнистого компонента. Формирующиеся волокна образуют оформленные тяжи, занимают значительную площадь в дермальном слое кожи и обладают высокими механическими характеристиками. Заключение Таким образом, при оценке волокнистого компонента и его механических свойств выявлено, что при использовании триазолотиадиазина уже на 14-е сутки эксперимента в рубцовой ткани формируются толстые коллагеновые волокна, сложенные в оформленные тяжи. Морфологическая картина коррелирует с механическими показателями, указывающими на более высокие прочностные свойства у образцов кожи из группы «триазол». К 21-м суткам во всех опытных группах формируется грануляционная ткань с развитым волокнистым компонентом. Также во всех группах наблюдается тенденция к увеличению площади, занимаемой коллагеновыми волокнами, и утолщение пучков в более поздние сроки. Особенно это характерно для группы «триазол», где коллагеновые волокна обладают значительной зрелостью. Данные морфологического анализа соотносятся с тем, что на 21-е сутки механические свойства образцов кожи улучшаются, что наиболее выражено в группе с тестируемым веществом - производным 1,2,3-триазоло-1,3,4-тиадиазина.

About the authors

I. M Petrova

Ural Federal University

D. V Zaitsev

Ural Federal University; Ural State Mining University; Institute of High-Temperature Electrochemistry

A. V Zhdanova

City Clinical Hospital No. 40

S. L Khatsko

Ural Federal University

O. A Vysokova

Ural Federal University

T. A Kalinina

Ural Federal University

T. V Glukhareva

Ural Federal University; Institute of Organic Synthesis, Ural Branch of Russian Academy of Sciences

References

Statistics

Views

Abstract - 80

PDF (Russian) - 22

Refbacks

• There are currently no refbacks.